金属硫蛋白α-和β-结构域的拆分
作者：淮 清 李建华
单位：淮清(中国科学院生态环境研究中心，北京100085)；李建华(中国原子能科学研究院，北京102413)
关键词：金属硫蛋白；结构域；拆分
摘 要 根据金属硫蛋白的两个结构域结合金属能力的差别 摘 要 根据金属硫蛋白的两个结构域结合金属能力的差别，拆分了金属硫蛋白中的α-和β-结构域。用该方法制得金属硫蛋白的α-和β-结构域中金属含量和氨基酸组成与理论值相当。
Preparation of α-Cd4MT and β-Cd4MT with ZnMt-2
Huai Qing, Li Jianhua1
, http://www.100md.com
(Research Center for Eco-environment,China Acad.Sciences,Beijing 100085; 1China Institute of Atomic Energy,Beijing 102413)
Abstract Due to the difference of binding ability of α-and β-do main MT with metals,a method for preparation of α-and β-domain MT with ZnMT-2 was reported.The c ontents of metal and amino acids in the α-and β-domain of MT prepared by thi s method are equal to that of the reference results.
Key Words Metallothionein, Domain, Preparation
, http://www.100md.com
金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸的金属结合蛋白。1957年首先从马肾分离出这种蛋白，它不仅参与调节生物体内微量元素储存、转运、代谢、重金属解毒和抗自由基损伤等[1]，并且与机体生长、发育、生殖、衰老、肿瘤的发生和防治以及应激反应有关。
MT中金属含量极高，且结合的金属离子种类及各自含量经常发生改变，但结合金属的总摩尔数相当恒定。重金属离子与MT结合的相对亲和程度同它们与典型硫醇化合时一致，即Zn(Ⅱ)[2]。
MT三级结构以两个结构域(Domain)为特征，即羧基末端包括31个氨基酸残基的α-Domain和氨基末端1～30位氨基酸残基的β-Domain。其β-Domain含有9个Cys，可螯合3个Zn(Ⅱ)/Cd(Ⅱ)或6个Cu(Ⅰ)，α-Domain含有11个Cys，可螯合4个Zn(Ⅱ)/Cd(Ⅱ)或5～6个Cu(Ⅰ)。体外金属离子重组实验表明，Cd(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)首先与α-Domain结合，然后才与β-Domain结合，而Cu(Ⅰ)则正好相反[3]。金属离子与MT结合时呈现协同效应，即一个金属离子的结合可促进后续离子的结合。因此，金属离子与MT各结构域间的结合总是全部结合。
, http://www.100md.com
根据金属硫蛋白的两个结构域结合金属能力的差别，我们提出了一种简单的拆分α-和β-Domain的方法，为更好地研究MT不同结构域的性质提供帮助。
1 材 料
MT-2是本实验室从ZnCl2皮下注射诱导过的家兔肝脏中提取和纯化，经检定为HPLC纯。枯草杆菌酶(cubtilisin)为Merck产品。所有其它试剂均为分析纯，所有溶液均用三级蒸馏水配制。
2 方 法
2.1 ZnMT含量的测定
ZnMT样品中蛋白含量用比色法测定，在0.02mol/L盐酸中，MT解离出结合的全部金属离子成为无规卷曲肽链，ε220=473001mol-1cm-1[4]。MT中巯基含量用改进的Ellman试剂(5×10-3mol/LDTNS-10-3mol/LEDTA-6mol/L盐酸胍-0.1mol/LPBS,pH7.3)测定，ε412=13900lmol-1cm-1。金属离子(Zn,Cd和Cu)含量在原子吸收分光光度计(Hitachi-180-80)用火焰法测定。
, http://www.100md.com
经实验测定，100mgZnMT-2溶解于5ml0.02mol/LPBS缓冲溶液(pH7.0)中，其蛋白质浓度为2.8×10-4mol/L，-SH含量为5.5×10-3mol/L，每个MT分子约含有6.7个Zn。
2.2 稳定Cu+溶液的制备
CuCl在含有1mol/LNaCl的0.1mol/LHCl中能以[CuCl2]-短时间稳定存在[5]，因此我们用新鲜配制的[CuCl2]-来与MT反应。
2.3 α-Cd4MT-Ⅱ样品的制备
α-Cd4MT的制备，10mgZnMT-2溶解于5ml0.02mol/LPBS缓冲溶液(pH7.0)中，加入0.56ml0.01mol/LCdCl2和0.42ml0.01mol/LEDTA，通N2放置1.5～2h，加入约0.3mg枯草杆菌酶，在4℃冰箱中放置16～18h。用预先用0.01mol/L(NH4)2CO3平衡好的SephadexG-75柱(1.6×60cm)分离，洗脱液用相同浓度的(NH4)2CO3，流速为1ml/min。收集洗脱液，适当稀释测每管在250nm的紫外吸收，并用AAS测Cd和Zn的含量。将α-Cd4MT峰溶液冷冻干燥得到MT-Ⅱ的α-domain。作α-Cd4MT氨基酸组成分析，其中疏基含量用改进的Ellman试剂测定，方法同1.2，并用AAS测得Cd的含量。已知MT-Ⅱ的α-domain摩尔质量为3127，ε250nm=68，180l.mol-1cm-1，通过测量其中-SH和Cd的含量可以得到-SH/Cd比。
, 百拇医药
2.4 β-Cu6MT-Ⅱ样品的制备
β-Cu6MT的制备，100mgZnMT-2溶解于5ml10.20mol/LPBS缓冲溶液(pH7.0)中，加入少量谷胱甘肽后，加入0.84ml0.01mol/L[CuCl2]-和0.56ml0.01mol/LEDTA，通N2放置1.5～2h，加入约0.3mg枯草菌酶，在4℃冰箱中放置16～18h。用预先用0.01mol/L(NH4)2CO3平衡好的SephadexG-75柱(1.6×60cm)分离，洗脱液用相同浓度的(NH4)2CO3，流速为1ml/min。收集洗脱液，适当稀释后测每管在260nm的紫外吸收，并用AAS测Cu和Zn的含量。将β-Cu6MT-Ⅱ峰溶液冷冻干燥得到MT-Ⅱ的β-Cu2MT-Ⅱ。作β-Cu6MT-Ⅱ氨基酸组成分析，并用AAS测Cu含量。
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3 结果和讨论
3.1 α-Cd4MT的分离和鉴定
由SephadexG-75柱分离α-Cd4MT的洗脱曲线可见，流出液在250nm的吸收峰与Cd峰完全一致，在此说明此峰为α-Cd4MT样品。表1为α-Cd4MT氨基酸组成分析结果，表1可见，所测得的α-Cd4MT氨基酸组成与理论值基本一致。
已知MT-Ⅱ的α-domain摩尔质量为3127，ε250nm=68，180l.mol-1cm[7]，通过测量其中-SH和Cd的含量可以得到-SH/Cd比。用改进的Ellman试剂测得-SH量以及样品中Cd含量的测量得到，每摩尔α-Cd4MT中含11.3摩尔-SH和约4摩尔Cd+2。
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Tab1 The contents of amino acids in α-Cd4MT
Amino
acid
Concentration
(nmol/ml)
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, 百拇医药 Ala
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Lys
199.1
4.8
5
3.2 β-Cu6MT-Ⅱ的分离和鉴定
, http://www.100md.com
SephadexG-75柱分离β-Cu6MT出现三个峰，经检测第一峰为MT聚合体峰，第二峰为β-Cu6MT-Ⅱ峰，第三峰为EDTA-Zn峰。收集β-Cu6MT峰，冷冻干燥后得到β-Cu6MT样品。表2为β-Cu6MT氨基酸组成分析结果，由表2可见，所测得的β-Cu6MT氨基酸组成与理论值基本一致。经AAS测定每个β-MT分子含约6个Cu+。Tab2 The contents of amino acids in β-Cu6MT
amino
acid
concentration
(nmol/ml)
, http://www.100md.com
number
of AA
reference
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2
Met
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Val
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1.9
2
由于CuMT极易被氧化，因此β-Cu6MT的制备应格外小心。实验条件应控制在无氧条件下进行，另外需加入少量还原剂，例如谷胱甘肽、巯基乙醇和二硫苏糖醇等。
, 百拇医药
中国国家自然科学基金和中国核工业总公司资助
参考文献
1 Hamer D.Metallothionein . Ann Rev B iochem, 1986,55∶913
2 Munger K,Germann UA.Beltramini,(Cu,Zn)-metallothionein from fetal bvine li ver.J Biol Chem, 1985,260∶10032
3 Nielson KB, Winge R . Preferential Binding of copper to the β domain of metallothionein. J Biol Chem, 1984,259∶4942
4 Buhler RHO,Kagi HR.Spectroscopic properties of zinc-metallothionein.In :Kagi J H R,and Nordber M.Metallothionein,Birkhause Verlag Basel,1979,211
5 Winge D.Copper coordination in metallothio-nein.Method Enzymol,1991,205∶458
6 Zelazowaki A,Szymanska J,Law A, et al. Spectroscopic properties of the α fr agment of metallothionein. J Biol Chem, 1984,259∶12960
收稿日期：1998-01-05, 百拇医药
单位：淮清(中国科学院生态环境研究中心，北京100085)；李建华(中国原子能科学研究院，北京102413)
关键词：金属硫蛋白；结构域；拆分
摘 要 根据金属硫蛋白的两个结构域结合金属能力的差别 摘 要 根据金属硫蛋白的两个结构域结合金属能力的差别，拆分了金属硫蛋白中的α-和β-结构域。用该方法制得金属硫蛋白的α-和β-结构域中金属含量和氨基酸组成与理论值相当。
Preparation of α-Cd4MT and β-Cd4MT with ZnMt-2
Huai Qing, Li Jianhua1
, http://www.100md.com
(Research Center for Eco-environment,China Acad.Sciences,Beijing 100085; 1China Institute of Atomic Energy,Beijing 102413)
Abstract Due to the difference of binding ability of α-and β-do main MT with metals,a method for preparation of α-and β-domain MT with ZnMT-2 was reported.The c ontents of metal and amino acids in the α-and β-domain of MT prepared by thi s method are equal to that of the reference results.
Key Words Metallothionein, Domain, Preparation
, http://www.100md.com
金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸的金属结合蛋白。1957年首先从马肾分离出这种蛋白，它不仅参与调节生物体内微量元素储存、转运、代谢、重金属解毒和抗自由基损伤等[1]，并且与机体生长、发育、生殖、衰老、肿瘤的发生和防治以及应激反应有关。
MT中金属含量极高，且结合的金属离子种类及各自含量经常发生改变，但结合金属的总摩尔数相当恒定。重金属离子与MT结合的相对亲和程度同它们与典型硫醇化合时一致，即Zn(Ⅱ)
MT三级结构以两个结构域(Domain)为特征，即羧基末端包括31个氨基酸残基的α-Domain和氨基末端1～30位氨基酸残基的β-Domain。其β-Domain含有9个Cys，可螯合3个Zn(Ⅱ)/Cd(Ⅱ)或6个Cu(Ⅰ)，α-Domain含有11个Cys，可螯合4个Zn(Ⅱ)/Cd(Ⅱ)或5～6个Cu(Ⅰ)。体外金属离子重组实验表明，Cd(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)首先与α-Domain结合，然后才与β-Domain结合，而Cu(Ⅰ)则正好相反[3]。金属离子与MT结合时呈现协同效应，即一个金属离子的结合可促进后续离子的结合。因此，金属离子与MT各结构域间的结合总是全部结合。
, http://www.100md.com
根据金属硫蛋白的两个结构域结合金属能力的差别，我们提出了一种简单的拆分α-和β-Domain的方法，为更好地研究MT不同结构域的性质提供帮助。
1 材 料
MT-2是本实验室从ZnCl2皮下注射诱导过的家兔肝脏中提取和纯化，经检定为HPLC纯。枯草杆菌酶(cubtilisin)为Merck产品。所有其它试剂均为分析纯，所有溶液均用三级蒸馏水配制。
2 方 法
2.1 ZnMT含量的测定
ZnMT样品中蛋白含量用比色法测定，在0.02mol/L盐酸中，MT解离出结合的全部金属离子成为无规卷曲肽链，ε220=473001mol-1cm-1[4]。MT中巯基含量用改进的Ellman试剂(5×10-3mol/LDTNS-10-3mol/LEDTA-6mol/L盐酸胍-0.1mol/LPBS,pH7.3)测定，ε412=13900lmol-1cm-1。金属离子(Zn,Cd和Cu)含量在原子吸收分光光度计(Hitachi-180-80)用火焰法测定。
, http://www.100md.com
经实验测定，100mgZnMT-2溶解于5ml0.02mol/LPBS缓冲溶液(pH7.0)中，其蛋白质浓度为2.8×10-4mol/L，-SH含量为5.5×10-3mol/L，每个MT分子约含有6.7个Zn。
2.2 稳定Cu+溶液的制备
CuCl在含有1mol/LNaCl的0.1mol/LHCl中能以[CuCl2]-短时间稳定存在[5]，因此我们用新鲜配制的[CuCl2]-来与MT反应。
2.3 α-Cd4MT-Ⅱ样品的制备
α-Cd4MT的制备，10mgZnMT-2溶解于5ml0.02mol/LPBS缓冲溶液(pH7.0)中，加入0.56ml0.01mol/LCdCl2和0.42ml0.01mol/LEDTA，通N2放置1.5～2h，加入约0.3mg枯草杆菌酶，在4℃冰箱中放置16～18h。用预先用0.01mol/L(NH4)2CO3平衡好的SephadexG-75柱(1.6×60cm)分离，洗脱液用相同浓度的(NH4)2CO3，流速为1ml/min。收集洗脱液，适当稀释测每管在250nm的紫外吸收，并用AAS测Cd和Zn的含量。将α-Cd4MT峰溶液冷冻干燥得到MT-Ⅱ的α-domain。作α-Cd4MT氨基酸组成分析，其中疏基含量用改进的Ellman试剂测定，方法同1.2，并用AAS测得Cd的含量。已知MT-Ⅱ的α-domain摩尔质量为3127，ε250nm=68，180l.mol-1cm-1，通过测量其中-SH和Cd的含量可以得到-SH/Cd比。
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2.4 β-Cu6MT-Ⅱ样品的制备
β-Cu6MT的制备，100mgZnMT-2溶解于5ml10.20mol/LPBS缓冲溶液(pH7.0)中，加入少量谷胱甘肽后，加入0.84ml0.01mol/L[CuCl2]-和0.56ml0.01mol/LEDTA，通N2放置1.5～2h，加入约0.3mg枯草菌酶，在4℃冰箱中放置16～18h。用预先用0.01mol/L(NH4)2CO3平衡好的SephadexG-75柱(1.6×60cm)分离，洗脱液用相同浓度的(NH4)2CO3，流速为1ml/min。收集洗脱液，适当稀释后测每管在260nm的紫外吸收，并用AAS测Cu和Zn的含量。将β-Cu6MT-Ⅱ峰溶液冷冻干燥得到MT-Ⅱ的β-Cu2MT-Ⅱ。作β-Cu6MT-Ⅱ氨基酸组成分析，并用AAS测Cu含量。
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3 结果和讨论
3.1 α-Cd4MT的分离和鉴定
由SephadexG-75柱分离α-Cd4MT的洗脱曲线可见，流出液在250nm的吸收峰与Cd峰完全一致，在此说明此峰为α-Cd4MT样品。表1为α-Cd4MT氨基酸组成分析结果，表1可见，所测得的α-Cd4MT氨基酸组成与理论值基本一致。
已知MT-Ⅱ的α-domain摩尔质量为3127，ε250nm=68，180l.mol-1cm[7]，通过测量其中-SH和Cd的含量可以得到-SH/Cd比。用改进的Ellman试剂测得-SH量以及样品中Cd含量的测量得到，每摩尔α-Cd4MT中含11.3摩尔-SH和约4摩尔Cd+2。
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Tab1 The contents of amino acids in α-Cd4MT
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5
3.2 β-Cu6MT-Ⅱ的分离和鉴定
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SephadexG-75柱分离β-Cu6MT出现三个峰，经检测第一峰为MT聚合体峰，第二峰为β-Cu6MT-Ⅱ峰，第三峰为EDTA-Zn峰。收集β-Cu6MT峰，冷冻干燥后得到β-Cu6MT样品。表2为β-Cu6MT氨基酸组成分析结果，由表2可见，所测得的β-Cu6MT氨基酸组成与理论值基本一致。经AAS测定每个β-MT分子含约6个Cu+。Tab2 The contents of amino acids in β-Cu6MT
amino
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由于CuMT极易被氧化，因此β-Cu6MT的制备应格外小心。实验条件应控制在无氧条件下进行，另外需加入少量还原剂，例如谷胱甘肽、巯基乙醇和二硫苏糖醇等。
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中国国家自然科学基金和中国核工业总公司资助
参考文献
1 Hamer D.Metallothionein . Ann Rev B iochem, 1986,55∶913
2 Munger K,Germann UA.Beltramini,(Cu,Zn)-metallothionein from fetal bvine li ver.J Biol Chem, 1985,260∶10032
3 Nielson KB, Winge R . Preferential Binding of copper to the β domain of metallothionein. J Biol Chem, 1984,259∶4942
4 Buhler RHO,Kagi HR.Spectroscopic properties of zinc-metallothionein.In :Kagi J H R,and Nordber M.Metallothionein,Birkhause Verlag Basel,1979,211
5 Winge D.Copper coordination in metallothio-nein.Method Enzymol,1991,205∶458
6 Zelazowaki A,Szymanska J,Law A, et al. Spectroscopic properties of the α fr agment of metallothionein. J Biol Chem, 1984,259∶12960
收稿日期：1998-01-05, 百拇医药